转录因子的异常调节会导致癌细胞的无限生长。Zic2基因对人类癌症的发生是关键的,然而它在肝癌(HCC)中的作用还不清楚。本研究数据显示Zic2在正常-癌症-转移癌组织中的表达水平逐渐增加。Zic2过表达会增加体内外肿瘤细胞的增殖和迁移,相反当Zic2敲低后会抑制。芯片结果显示PAK4是Zic2的潜在靶标,Zic2的敲低会减少PAK4的表达,Zic2表达恢复后会增加PAK4的表达。ChIP和荧光素酶实验显示Zic2直接结合到PAK4的启动子区,调节其活性。PAK4被干扰后,通过调节Raf/MEK/ERK通路可以减弱Zic2对细胞生长的调节作用。在615个病人中,Zic2与PAK4呈正相关,并与差的无病生存率有关。多元分析显示Zic2和PAK4在HCC中是独立的指示因子。另外,Zic2的表达与miR-1271表达呈负相关,miR-1271的导入会减弱Zic2对细胞增殖和迁移的促进作用。总之,本文结果表明miR-1271/Zic2/PAK4axis在肝癌发展中起重要作用,可以作为一个潜在的肝癌治疗的靶标。
 

研究结果


1.Zic2在肝癌中表达上调并与差的临床结果有关

对原发性肝癌及癌旁组织进行表达谱芯片分析,找到300个差异表达的mRNA,Zic2上调3.71倍。Zic2mRNA的过表达在46对HCC样本中被证实,Zic2的蛋白水平在39对样本中明显增加2.97倍。与永生化肝细胞系相比,在HCC肝癌细胞系中Zic2是显著上调的。在正常-癌症-转移癌组织中Zic2的表达逐渐增加。与原发瘤相比,在77.8%(63/81)的转移瘤中Zic2的表达明显升高,结果通过免疫组化实验证实。Kaplane-Meier生存分析显示高表达的Zic2会导致更差的总生存率和无病生存率。
 

  

图1在肝癌中Zic2基因表达上调并与不良结局相关


2.Zic2促进细胞增殖和迁移

Zic2分别被敲低和过表达,当过表达时细胞生长能力提高,敲低时生长能力随之降低。另外,克隆形成实验及迁移实验结果均与上述结果一致。表明Zic2能促进细胞增殖和迁移。
 

 

图2肝细胞癌中Zic2促进细胞增殖和迁移


3.Zic2使PAK4上调

Zic2被干扰后进行表达谱芯片分析,结果显示有1900多个基因差异表达,其中PAK4是最显著下调的一个基因。分别对Zic2进行干扰或过表达,当Zic2被干扰时PAK4的mRNA和蛋白水平下降,当Zic2过表达时则会上升。双荧光素酶报告实验显示Zic2表达增加时会提高PAK4启动子的转录活性,反之则会降低。ChIP实验也证实了该结果。
 

 

图3Zic2使PAK4上调


4.Zic2和PAK4在HCC临床样本中是有关联的,并显示差的生存率

在46个HCC新鲜组织中,Zic2mRNA与PAK4mRNA表达呈正相关(r=0.7007,P<0.0001)。Zic2protein和PAK4mRNA也呈明显正相关(r=0.7007,P=0.0202)。高表达的Zic2通常伴随着高表达的PAK4,Zic2和PAK4蛋白水平之间也显示了正相关。高表达的PAK4明显与差的全部存活率及无病生存率有关。结合分析还显示同时低表达的Zic2和PAK4有最高的生存率。
 

 

图4临床样本中Zic2和PAK4具有相关性且能预示不良结局


5.PAK4的敲低或干扰Raf/MEK/ERK通路会减弱Zic2促进的细胞增殖和迁移

MTT实验显示PAK4被干扰后可明显减少HCC细胞的存活和增殖,当PAK4被敲低后可减弱Zic2对细胞的促进作用,克隆形成实验和侵袭迁移实验也证实了该结果。当PAK4表达增加后Raf/MEK/ERK通路被激活,表现出的是Raf,MEK,ERK的磷酸化水平增加。体内数据显示Zic2过表达加速了移植瘤的生长,瘤子的重量和体积都是增加的。另外,还发生了肺转移现象。以上数据说明Zic2可促进细胞增殖转移,一定程度上是通过上调PAK4实现的。而且作者还通过实验发现Zic2是通过PAK4/MEK/ERK通路促进细胞生长的。
 

 

图5PAK4的敲低会减弱Zic2促进的细胞生长


6.在HCC中Zic2是miR-1271的直接靶标

通过软件预测(miRanda,miRtarget,Targetscan)发现Zic2是miR-1271的潜在靶标,miR-1271在HCC细胞系和46个HCC组织中显著减少。将miR-1271导入细胞中会降低Zic2和PAK4的表达水。双荧光素酶报告实验证明Zic2是miR-1271的直接靶标。在临床样本中,Zic2与miR-1271呈负相关。
 

 

图6在HCC细胞中Zic2是miR-1271的直接靶标


参考文献:
LuSX,ZhangCZ,LuoRZ,etal.Zic2promotestumorgrowthandmetastasisviaPAK4inhepatocellularcarcinoma[J].CancerLetters,2017.